VESÍCULAS EXTRACELULARES DERIVADAS DE CÉLULAS ESTROMALES MESENQUIMALES MODIFICADAS GENÉTICAMENTE PARA SOBRE-EXPRESAR IGF-I EMPLEADAS COMO HERRAMIENTA TERAPÉUTICA PARA LA FIBROSIS HEPÁTICA

Abstract

RESUMEN La cirrosis o fibrosis hepática avanzada es generada por diferentes agentes etiológicos como el alcohol, virus de hepatitis B o C, autoinmunidad, alteraciones metabólicas, entre otros. Se trata de un proceso patológico crónico caracterizado por ciclos repetidos de necrosis de hepatocitos, inflamación y cicatrización, donde las células estrelladas hepáticas (CEHs) se activan ante el daño y secretan de manera excesiva diversos componentes de la matriz extracelular (MEC). En este escenario, los macrófagos hepáticos (hMø) cumplen un rol crítico tanto en la progresión de la enfermedad, amplificando los estímulos fibrogénicos, como en la resolución de la fibrosis hepática, promoviendo la degradación de la MEC si el daño se interrumpe. Si esto no ocurre, la acumulación de MEC conduce a la pérdida progresiva de la funcionalidad hepática pudiendo, finalmente, llevar a una cirrosis descompensada. En la actualidad, el trasplante de hígado es la única alternativa terapéutica eficaz para la enfermedad hepática terminal, pero lamentablemente los órganos disponibles son insuficientes para satisfacer la elevada demanda. Se estima que anualmente y a nivel global mueren 2 millones de personas por enfermedades hepáticas, por lo que es urgente encontrar nuevos tratamientos para estos pacientes. En este contexto, la terapia celular surge como alternativa terapéutica para la regeneración de los tejidos sometidos a injuria. Las células madre/estromales mesenquimales (MSCs del inglés: Mesenchymal Stem/Stromal Cells) son células multipotentes capaces de migrar selectivamente al tejido dañado y contribuir a su reparación/regeneración. Las principales fuentes de uso clínico para aislar MSCs son la médula ósea, el tejido adiposo y el cordón umbilical. Otra fuente innovadora con gran potencial terapéutico son las células madre pluripotentes inducidas (iPSC del inglés, induced Pluripotent Stem Cells). El efecto pro-regenerativo de las MSCs se debe a su capacidad para producir y secretar factores que promueven la protección y supervivencia celular, como así también regular la respuesta inmunológica. Se ha observado que parte de este mecanismo paracrino está mediado por vesículas extracelulares (EVs, del inglés 5 Extracelullar Vesicles) que contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (ADN, ARNm, miARN, lncARN) y participan de la comunicación intercelular. Debido a que pueden reproducir el efecto de la célula de origen, las EVs derivadas de MSCs también se han convertido en una opción terapéutica con alto potencial para distintas enfermedades. En trabajos previos de nuestro grupo de investigación demostramos, mediante una combinación de terapia génica y terapia celular, que MSCs derivadas de médula ósea de ratón modificadas genéticamente para sobreexpresar el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) murino ejercen un efecto antifibrótico y pro-regenerativo. La importancia de IGF-1 radica, al menos en parte, en que es una potente hormona citoprotectora cuya síntesis hepática está significativamente disminuida como consecuencia de la insuficiencia hepatocelular. Considerando todos estos antecedentes, el objetivo general de este trabajo de tesis fue estudiar los mecanismos efectores mediados por vesículas extracelulares (EVs) de MSCs humanas modificadas genéticamente para sobre-expresar IGF-1 humano y su aplicación como herramienta terapéutica para la fibrosis hepática avanzada. En la primera parte de este trabajo de tesis, diseñamos un adenovirus recombinante para sobre-expresar IGF-1 humano (AdhIGF-I) en MSCs y optimizamos las condiciones de transducción. Demostramos que la infección con AdhIGF-I de células perivasculares de cordón umbilical (HUCPVCs, del inglés Human Umbilical Cord Perivascular Cells) como fuente de MSCs indujo una producción significativa de IGF-1 y, en las condiciones optimizadas, no se afectó su fenotipo, viabilidad ni capacidad anti-inflamatoria. En la segunda parte de este trabajo, demostramos el potencial terapéutico de las HUCPVCs transducidas con el AdhIGF-I en la fibrosis hepática experimental y estudiamos el papel de las EVs en sus mecanismos efectores. Para esto, primero demostramos in vitro que la depleción de EVs reduce el efecto anti-fibrótico del medio condicionado de las AdhIGF-I-HUCPVCs sobre CEHs. Luego, se aislaron EVs por ultracentrifugación diferencial a partir del medio condicionado de AdhIGFI-HUCPVCs y evaluamos el efecto anti-fibrótico in vivo. De manera similar a la 6 terapia celular, el tratamiento con EVs derivadas de AdhIGF-I-HUCPVCs dió como resultado una reducción de los depósitos de colágeno y la expresión de genes profibrogénicos (TGF-β1, α-SMA y COL1A2) en el tejido hepático. Complementariamente, demostramos en ensayos in vitro que la incubación con EVs derivadas de AdhIGF-I-HUCPVC redujo significativamente la activación de las CEHs y moduló el perfil funcional de hMø desde un perfil proinflamatorio hacia uno anti-inflamatorio. Asimismo, es importante resaltar que tanto los efectos in vivo como in vitro de EVs derivadas de AdhIGF-I-HUCPVCs fueron superiores a los efectos de las EVs derivadas de HUCPVCs sin la sobreexpresión de IGF-1. Consistentemente, observamos que las EVs derivadas de AdhIGF-I-HUCPVC contienen niveles significativamente más altos de IGF-1 en comparación con las EVs derivadas de HUCPVCs donde es prácticamente indetectable. En conjunto, estos resultados demuestran que las EVs derivadas de MSCs se pueden diseñar para cargar y transportar factores terapéuticos específicos como IGF-1. Considerando que una de las principales limitaciones actuales para trasladar los resultados que se observan en las terapias experimentales con EVs es contar con métodos de purificación que permitan obtener preparaciones de vesículas en calidad y cantidad clínica para su uso en pacientes, en la tercera parte de esta tesis, trabajamos en el desarrollo de una metodología con potencialidad de escalado para la purificación EVs derivadas de MSCs. Para esto empleamos una herramienta basada en cromatografía de intercambio iónico para la purificación de EVs derivadas de MSCs ingenierizadas para transportar factores terapéuticos para el tratamiento de la fibrosis hepática. El primer paso fue validar si las EVs aisladas por el método escalable de cromatografía de intercambio iónico mantienen las mismas propiedades que las EVs aisladas por ultracentrifugación. A partir de la caracterización fenotípica y funcional, comprobamos que las EVs obtenidas por este método conservan los marcadores de superficie, tamaño y forma típicas, como así también su efecto anti-fibrótico in vitro. Posteriormente, comparamos tres fuentes de interés clínico de MSCs para seleccionar la más óptima en la producción a gran escala de EVs y en el mantenimiento de sus propiedades regenerativas y anti-fibróticas. Con este fin se aislaron EVs por el método cromatográfico a partir de 7 sobrenadantes de MSCs derivadas de tejido adiposo, iPSCs y HUCPVCs, y comprobamos que los tres tipos de EVs mostraron un fenotipo y potencial anti-fibrótico/pro-regenerativo similar. Finalmente, para comprobar si el método cromatográfico puede aplicarse para aislar EVs ingenierizadas para transportar cargas específicas, aislamos EVs derivadas de AdhIGF-I-HUCPVCs y confirmamos que conservan sus características fenotípicas y también que cargan IGF-1. Más importante aún, demostramos que estas EVs derivadas de AdhIGF-I-HUCPVCs mantienen el potencial anti-fibrótico/pro-regenerativo. En resumen, los resultados de este trabajo de tesis muestran que las EVs median, al menos en parte, el mecanismo paracrino por el cual las AdhIGF-I-HUCPVCs reducen la fibrosis hepática, y que pueden utilizarse como sistema de delivery de factores terapéuticos. Además, demostramos que es posible aplicar el método escalable de aislamiento por cromatografía de intercambio iónico para purificar EVs ingenierizadas derivadas de MSCs. Finalmente, la evidencia actual y la aportada por los resultados de este trabajo de tesis doctoral posicionan a esta herramienta terapéutica como una opción valiosa en la búsqueda de nuevas alternativas de tratamiento para enfermedades hepáticas crónicas como la cirrosis.