EXPRESIÓN DEL FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE MACRÓFAGOS Y GRANULOCITOS EN CÉLULAS MESENQUIMALES ESTROMALES MEDIANTE ARNm TRANSCRIPTO IN VITRO. UNA ESTRATEGIA TERAPÉUTICA PARA EL HEPATOCARCINOMA CELULAR

Abstract

Resumen Las células estromales mesenquimales (MSC) se han utilizado como transportadoras de agentes antitumorales debido a su capacidad de migrar y anclarse a tumores. El ARNm transcripto in vitro (ARNm IVT) es una herramienta prometedora para una expresión de proteínas transitoria, eficaz y sin riesgos mutagénicos. También se ha demostrado que el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) reduce el crecimiento tumoral al favorecer un aumento de la circulación de células presentadoras de antígenos y subsecuentemente el desarrollo de una respuesta inmune antitumoral. Este trabajo tuvo como objetivo expresar GM-CSF en MSC mediante el uso de ARNm IVT y evaluar el efecto terapéutico de las MSC que expresan GM-CSF (MSC/GM-CSF) en combinación con dosis bajas de doxorrubicina (Dox), en un modelo murino de carcinoma hepatocelular (HCC). Se generaron ARNm IVT de DsRed (proteína fluorescente utilizada como control de expresión) o GM-CSF a partir de un molde de ADN copia diseñado con cebadores específicos seguidos de transcripción inversa. Se usó lipofectamina para transfectar a las MSC con el ARNm IVT de DsRed (MSC/DsRed) o de GM-CSF (MSC/GM-CSF). La expresión génica y los niveles de marcadores de superficie celular se determinaron mediante citometría de flujo. La secreción de GM-CSF se determinó mediante ELISA. Para probar la función de GM-CSF, se utilizaron la línea de macrófagos J774 y monocitos de médula ósea de ratones. Se desarrolló un modelo de HCC mediante inoculación subcutánea (s.c.) de células Hepa129 singénicas de ratones C3H/HeN. Los animales con tumor palpable se dividieron aleatoriamente en grupos. Se evaluó la administración de MSC/GM-CSF, Dox o su combinación, estudiando el crecimiento del tumor y la supervivencia del ratón, a lo largo de un mes. Se recogieron muestras de los tumores para el análisis de citoquinas y diversas proteínas a través de la expresión del ARNm y además se identificaron células del sistema inmune por citometría de flujo. 4 La expresión de DsRed se observó 2 h después de la transfección con el ARNm IVT DsRed y no se registraron cambios significativos en el crecimiento del tumor in vivo de animales administrados con MSC/DsRed en comparación con el grupo control (administrados con el vehículo). Para las pruebas realizadas con ARNm IVT GM-CSF, se observó que las MSC/GM-CSF mantuvieron la expresión de los marcadores de superficie, sugiriendo que la transfección no genera cambios fenotípicos en estas células. Por ELISA se detectó GMCSF en el sobrenadante de cultivo de las MSC/GM-CSF (MC, medio condicionado), confirmando que las células eran capaces de producir la proteína y secretarla adecuadamente. Por otro lado, el MC de las MSC/GM-CSF, indujo la diferenciación de monocitos murinos en células dendríticas y promovió un fenotipo proinflamatorio en células J774. In vivo, la aplicación de MSC/GM-CSF en combinación con Dox, redujo significativamente el crecimiento del tumor subcutáneo de HCC en ratones C3H/HeN y extendió la supervivencia de los mismos en comparación con los tratamientos individuales y el grupo control (administrado con solución fisiológica). Además, los tumores en el grupo tratado con MSC/GM-CSF + Dox, exhibieron niveles elevados de genes proinflamatorios y una mayor infiltración de células T CD8+ y macrófagos. Nuestros resultados demostraron que la transfección con ARNm IVT es una estrategia adecuada para obtener MSC modificadas para fines terapéuticos. Las MSC/GM-CSF en combinación con dosis bajas de Dox produjo un efecto sinérgico al aumentar el microambiente tumoral proinflamatorio, lo que a su vez mejoró la respuesta antitumoral en el HCC.