AVANCES EN EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ATAXIAS HEREDITARIAS: IMPLEMENTACIÓN DE ESTRATEGIAS DE SECUENCIACIÓN DE NUEVA GENERACIÓN Y DE LECTURAS LARGAS EN UNA COHORTE ARGENTINA

Abstract

RESUMEN Las ataxias hereditarias (AH) representan una de las consultas más frecuentes en la Neurogenética Clínica. Con más de 50 subtipos identificados, estas enfermedades muestran una gran heterogeneidad genética y fenotípica, lo que dificulta significativamente su diagnóstico molecular. La identificación de la causa genética subyacente es crucial para proporcionar un tratamiento y asesoramiento personalizado a los pacientes. La secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés) ha mostrado gran utilidad para estudiar las AH, permitiendo la identificación de nuevos genes y variantes asociadas desde su implementación. Sin embargo, NGS presenta limitaciones, especialmente debido que la secuenciación se basa en la obtención de fragmentos cortos que no permiten, a priori, el análisis de variantes estructurales y elementos repetitivos, estos últimos causales de los subtipos de ataxias más frecuentes. Para superar estas limitaciones, se ha desarrollado la secuenciación de lecturas largas (LRS, por sus siglas en inglés), que genera secuencias continuas desde 10 kilobases (Kb) hasta varios megabases (Mb) directamente a partir de ADN nativo. Esta tecnología en consecuencia ofrece la posibilidad de caracterizar las regiones repetitivas etiopatogénicas del genoma en ataxias causadas por expansiones de nucleótidos. La escasez de recursos y la gran heterogeneidad de estas enfermedades poco frecuentes destacan la necesidad de métodos de diagnóstico más eficientes y precisos. En Argentina, aunque han habido avances en la comprensión de las AH (41,42), aún falta conocimiento sobre la prevalencia de estos trastornos y los mecanismos mutacionales específicos Además, la identificación de factores modificadores genéticos que podrían influir en la gravedad y el curso clínico de las AH es un área de investigación prometedora en este campo. Conocer la frecuencia de los subtipos de AH en nuestra población y los fenotipos asociados permitiría aplicar una metodología diagnóstica racional, priorizando el estudio de los genes con mayor probabilidad de resultados positivos en cada paciente. El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos involucrados en las AH, utilizando metodologías novedosas en secuenciación genómica para identificar mutaciones etiopatogénicas y factores modificadores genéticos en una población de pacientes afectados por estos trastornos. El primer objetivo específico consistió en realizar un análisis sistemático para evaluar exhaustivamente la estrategia de diagnóstico genético-molecular integral implementada por el grupo de Neurogenética de la División de Neurología del Hospital J.M. Ramos Mejía. Se realizó un estudio exploratorio, prospectivo y descriptivo en 334 pacientes con ataxia progresiva evaluados entre mayo de 2008 y diciembre de 2019. Los pacientes fueron estratificados según la probable herencia autosómica dominante, recesiva y esporádica, empleando un algoritmo diagnóstico clínico- Tesis de Doctorado FCB, UA | Josefina Perez Maturo 4 molecular. Los estudios moleculares incluyeron secuenciación de genes individuales, caracterización de expansiones de nucleótidos, secuenciación multigénica de nueva generación, de exoma y genoma completo. El algoritmo diagnóstico desarrollado permitió identificar el defecto genético en 113 sujetos, obteniendo un rédito diagnóstico del 33.8%. Este porcentaje fue mayor en pacientes con historia familiar positiva (55%), especialmente en ataxias recesivas (71%), lo que destaca la importancia de los antecedentes familiares en el diagnóstico. La ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2) (36%) y la de ataxia de Friedreich (AF) (62%) fueron las más prevalentes en nuestra cohorte. Durante el estudio, se construyó un panel multigénico virtual para el análisis de NGS, fundamental para el filtrado y la interpretación clínica de los archivos de variantes VCF (Variant Call Format). Este panel permitió priorizar variantes basadas en modelos de herencia, frecuencia poblacional, función molecular y patogenicidad informada y clasificarlas según los criterios de la ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics). . Para el segundo objetivo, se exploró la utilidad de la secuenciación de tercera generación (LRS) desarrollada por Oxford Nanopore Technologies (ONT) para el diagnóstico de las AH y la caracterización molecular de las regiones etiopatogénicas del genoma en las ataxias causadas por expansiones de TR. Se evaluaron tres estrategias de captura y enriquecimiento de regiones repetitivas: a) CRISPR/Cas9, b) panel de genes, y c) muestreo adaptativo. Con las estrategias b y c se logró cuantificar el número de expansiones y caracterizar la composición de la región repetitiva en genes asociados a SCA1, SCA2, SCA3, SCA17 y AF. Con el muestreo adaptativo, además, se lograron identificar variantes puntuales, lo que amplía el rango de variantes a ser analizadas en un único estudio. Además, el hecho de que el muestreo adaptativo utilice un panel de genes virtual que puede ser fácilmente adaptable a la sintomatología del paciente permite pensar en conjunto con la portabilidad de la tecnología de ONT, en el desarrollo de pruebas moleculares más accesibles, rápidas, abarcativas y personalizadas. En conclusión, esta investigación logró integrar con éxito los recursos clínicos y de laboratorio académico de un hospital terciario, proporcionando una visión completa del panorama mutacional de las ataxias genéticas en Argentina. Representa la serie más grande de AH estudiadas en nuestra región, sentando las bases para implementar algoritmos de diagnóstico genético de manera más efectiva para estos trastornos en nuestro país. Además, se validó la utilidad de un panel de genes para el análisis de NGS. La exploración de tecnologías de secuenciación de tercera generación permitió, además, evaluar su funcionalidad en este campo y pensar nuevas estrategias de diagnóstico molecular que orienten hacia medicina verdaderamente personalizada. Sin embargo, es evidente que se requiere más trabajo y la implementación de acciones públicas que fomenten un uso más amplio de recursos y tecnologías de diagnóstico avanzadas para mejorar aún más el diagnóstico Tesis de Doctorado FCB, UA | Josefina Perez Maturo 5 en este campo en constante evolución, con el objetivo último de reducir el impacto tanto individual como familiar de estas devastadoras condiciones neurodegenerativas